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  • Tecnologias para detecção e vigilância de arbovírus

    O CADDE está trabalhando no desenvolvimento, validação e aplicação de novas tecnologias de seqüenciamento de genoma para caracterizar arbovírus conhecidos e desconhecidos em populações humanas, em populações de vetores sentinela (mosquitos) e em reservatórios não-humanos.

    Embora o seqüenciamento completo do genoma forneça informações poderosas para entender a propagação e a dinâmica de um surto em tempo real, métodos virológicos tradicionais (ou seja, detecção do genoma do vírus por meio do RT-qPCR ou isolamento do vírus nas linhas celulares) e / ou métodos sorológicos, como ELISA ou PRNT continuam sendo o padrão-ouro para detecção e vigilância de arbovírus nas Américas. As abordagens de sequenciamento de ponta devem se basear nas ferramentas existentes e complementar os métodos de vigilância padrão. Informações detalhadas sobre detecção e diagnóstico laboratorial podem ser encontradas no site da Organização Pan-Americana da Saúde para vários arbovírus, incluindo vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus Zika, vírus chikungunya e vírus mayaro.

    PCR multiplex

    O protocolo multiplex-PCR foi desenvolvido por Josh Quick e Nick Loman como parte do projeto ZiBRA e pode ser encontrado aqui .

    Esquemas de iniciação

    Cada esquema é um conjunto de pares de oligonucleotídeos iniciadores que geram produtos sobrepostos. Os esquemas de primers validados e não validados (consulte isenção de responsabilidade de disponibilidade de dados abaixo) publicados nas citações abaixo podem ser baixados no formato CSV:

    Isenção de responsabilidade por disponibilidade de dados

    Os esquemas de cartilha relatados aqui estão sendo compartilhados antes da publicação para ajudar as comunidades de pesquisa e saúde pública a responder a surtos de doenças do arbovírus em andamento ou futuros. Observe que esses dados ainda são baseados em trabalhos em andamento e devem ser considerados preliminares. Nossa análise e validação de esquemas de primers não publicados estão em andamento e as publicações que comunicam nossas descobertas estão em preparação. O CADDE distribuirá esses dados para qualquer entidade ou colaborador que precise. Se você pretende usar esses dados antes de nossa publicação, entre em contato com os Profs. Ester Sabino, Nuno Faria e Nick Loman para coordenar.

    Metagenômica do SmartPlex

    Este é um protocolo Smart-Seq (mecanismo de comutação no final de 5 ′ de modelos de RNA) usando priming 9-n aleatório. O protocolo é compatível com os adaptadores rápidos com código de barras RLB da Oxford Nanopore Technologies RLB, disponíveis no kit SQK-RPB004. Este protocolo foi desenvolvido e testado por Josh Quick e Ingra Claro. Por favor, cite o contato de Josh Quick e Nick Loman para obter informações adicionais e citação apropriada.

    Lista de reagentes:

    • Filtro centrífugo Ultrafree-MC (10228490)
    • Kit ZymoBIOMICS DNA Microprep com tubos de lise (D4301)
    • Kit viral rápido de RNA (R1034)
    • Turbo DNase (Thermo Fisher, AM2238)
    • Kit de limpeza Zymo Research, (Zymo, R1015)
    • SuperScript IV (15307696)
    • RNase OUT (10777019)
    • Ampure XP 60 ml (A63881)
    • LongAmp Taq 2X Master Mix (M0287)

    Lista de oligos necessários:

    • TSL RLB (RNA oligo)
    • GCTAATCATTGCTTTTTCGTGCGCCGCTTCAACATrGrGrG
    • RLB RT 9N
    • TTTTTCGTGCGCCGCTTCAACNNNNNNNNN
    • PCR RLB (não obrigatório, mas útil para testes)
    • TTTTTCGTGCGCCGCTTCA

    Etapa 1 . Filtragem centrífuga

    • Transfira até 500 ul diretamente para uma coluna de filtro centrífugo Ultrafree-MC
    • Gire a 5.000 xg por 1 min
    • Recupere o filtrado em um tubo de 1,5 ml
    • Remova a cesta e descarte
    • Feche a tampa e coloque no gelo

    Etapa 2. Extração de RNA viral

    • Em um tubo Eppendorf de 2 ml, combine 200 µl de amostra, 200 µl de DNA / RNA Shield (2x concentrado) e misture bem com pipeta
    • Adicione 800 ul de tampão de RNA viral e misture bem com pipeta
    • Carregue 600 ul em uma coluna em um tubo de coleta e gire a 10.000 xg por 15 s para descartar o fluxo, coloque em um novo tubo de coleta
    • Adicione 500 ul de tampão de lavagem viral e gire a 10.000 xg por 15 s, descarte o fluxo através
    • Adicione 500 ul de etanol a 100% e gire a 10.000 xg por 1 min, descarte o fluxo e coloque-o em um tubo limpo de 1,5 ml
    • Adicione 15 ul de água livre de DNA / RNA e incube à temperatura ambiente por 3 minutos
    • Gire a 10.000 xg por 15 s

    Etapa 3. Tratamento com DNase

    • Defina o bloco de calor para 37 ° C
    • Configure a seguinte reação
    • RNA – 44 ul
    • 10X TURBO DNase Buffer 5 ul
    • TURBO DNase – 1 ul
    • Incubar a 37 ° C por 30 minutos

    Etapa 4. Limpeza da DNase

    • Adicione 100 ul de tampão de ligação a RNA e misture em vórtice 5 segundos e gire para baixo
    • Adicione 150 ul de etanol a 100% e misture em vórtex por 15 segundos e gire para baixo
    • Transfira 300 ul para uma coluna Zymo-Spin IC em um tubo de coleta de 2 ml e gire a 6000 xg por 15 segundos, descartando o fluxo através
    • Adicione 400 ul de tampão de preparação de RNA e gire a 6000 xg por 15 s, descarte o fluxo através
    • Adicione 700 ul de tampão de lavagem de RNA e gire a 6000 xg por 15 s, descarte o fluxo e coloque-o em um novo tubo de 1,5 ml
    • Adicione 10 ul de água livre de DNase / RNase e incube à temperatura ambiente por 1 min
    • Gire a 6000 xg por 15 segundos
    • Rotule como “RNA viral” e coloque no gelo

    Etapa 5. Extração de DNA viral

    • Defina o bloco de calor para 55 ° C
    • Em um tubo Eppendorf de 2 ml, combine 200 µl de amostra, 200 µl de DNA / RNA Shield (concentrado 2X), 20 µl de proteinase K e misture bem pipetando
    • Incubar a 55 ° C por 30 minutos
    • Defina o bloco de calor para 60 ° C
    • Adicione 1.200 ul de tampão de ligação e misture bem
    • Carregue 800 ul em uma coluna Zymo-Spin IIC-Z em um tubo de coleta e gire a 8.000 xg por 15 s, descarte o fluxo e recarregue quantas vezes forem necessárias
    • Transfira para um novo tubo de coleta, adicione 400 ul de tampão de lavagem de DNA 1 e gire a 8.000 xg por 15 s, descarte o fluxo
    • Adicione 700 ul de tampão de lavagem de DNA 2 e gire a 8.000 xg por 15 segundos
    • Adicione 200 ul de tampão de lavagem de DNA 2 e gire a 8.000 xg por 1 min
    • Transferir para um novo tubo de 1,5 ml e 50 ul de água livre de DNA / RNA pré-aquecido a 60 ° C para a coluna, incubar à temperatura ambiente por 1 min
    • Gire 8.000 xg por 1 minuto

    Etapa 6. Amplificação do Smart-9n

    • Combine o seguinte:
    • RLB RT 9N (2 uM) 1 ul
    • dNTPs (10 mM ea.) 1 ul
    • Modelo RNA 10 ul
    • Misture e gire para baixo
    • Incubar a 65 ° C por 5 minutos e depois esfriar no gelo
    • Crie o seguinte mix principal
    • Buffer SSIV (5x) 4 ul
    • TDT (100 mM) 1 ul
    • RNase OUT 1 ul
    • SS IV RTase (200 U / ul) 1 ul
    • TSL RLB (2 uM) 1 ul
    • Adicione 8 ul a 12 ul de RNA recozido

    Inicie o seguinte programa

    • 42 ° C por 90 minutos
    • 70 ° C por 10 minutos

    Amplifique adicionando 5 ul de cDNA a cada reação de PCR:

    • LongAmp Taq 2X master mix 25 ul
    • RLB (01-12) 0,5 ul
    • NFW – 19,5 ul

    Inicie o seguinte programa de PCR:

    • 95 ° C 45 s
    • 26 ciclos 95 ° C 15 s
    • 56 ° C 15 s
    • 65 ° C 5 min
    • 65 ° C 10 min.
    • 4 ° C de espera
    • Limpe produtos com 1x Ampure XP e elua em 30 ul EB

    Etapa 7. Controle de qualidade

    • Quantifique o DNA usando o Qubit HS
    • Executar em DNA TapeScreen genômico

    Etapa 8 . Acessório do adaptador

    • Associe todos os produtos com código de barras a um total de 200 fmol em 10 μl de Tris-HCl 10 mM pH 8,0 com NaCl 50 mM
    • Adicione 1 ul de RAP e misture por pipetagem, incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos

    Disponibilidade de protocolos

    Os protocolos aqui relatados estão sendo compartilhados pré-publicação para ajudar as comunidades de pesquisa e saúde pública a responder a surtos de doenças causadas por arbovírus em andamento ou futuros. Observe que este protocolo ainda é baseado em trabalhos em andamento e deve ser considerado preliminar. Validação adicional está em andamento e publicações que comunicam nossas descobertas estão em preparação. O CADDE distribuirá esses dados para qualquer entidade ou colaborador que precise. Se você pretende usar este protocolo antes da nossa publicação, entre em contato com os Profs. Ester Sabino, Nuno Faria e Nick Loman para coordenar.

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